Historie fosfo-protilátek

Vítejte na našem webu!

Jak jsme slíbili, čeká vás zde zajímavý článek o historii protilátek proti fosforylovaným epitopům signalizačních proteinů.

Tyto protilátky hrají zásadní roli ve výzkumu buněčné signalizace a regulace – a jejich využití vám umožní lépe porozumět dynamice buněčných procesů, jako je růst, diferenciace a apoptóza. Ale to není všechno! Pokud právě hledáte kvalitní primární protilátky nejen proti fosforylovaným proteinům, určitě byste neměli přehlédnout nabídku našeho partnera PhosphoSolutions. Tento výrobce nabízí jeden z nejrozsáhlejších výběrů protilátek proti fosforylovaným doménám – celkem téměř 1000 klonů, z toho 268 specifických pro fosforylované proteiny.

Seznam všech fosfo protilátek Phosphosolutions validovaných na IHC a ICC naleznete ZDE

Přečtěte si článek níže a podívejte se na rozsáhlou databázi protilátek PhosphoSolutions, která vám může pomoci najít přesně to, co potřebujete pro váš výzkum.

Historie fosfo-protilátek

Vynález fosfo-specifických protilátek znamenal revoluci ve studiu funkce proteinů.

Ator: Mike Browning a Amy Archuleta

U proteinů platí, že forma je funkce.

Proteiny dělají to, co dělají, díky svému tvaru. Strukturní bílkoviny pracují neustále, aby podpořily buněčnou strukturu. Jiné proteiny zprostředkovávají biologické funkce (např. buněčné dělení), které musí být regulovány - vypínány a zapínány podle potřeby buňky. Fosforylace bílkovin je základním buněčným mechanismem pro regulaci struktury bílkovin, a tedy i jejich aktivity. K fosforylaci bílkovin dochází, když proteinkináza přenese fosfát z ATP na serinové, treoninové nebo tyrosinové zbytky cílové bílkoviny. Přidáním záporně nabité fosfátové skupiny se změní tvar, a tím i funkce cílového proteinu.

Fosfoproteiny jsou považovány za jedny z nejdůležitějších proteinů v těle.

Fosfoproteiny jsou bílkoviny, které regulují téměř všechny buněčné procesy, od buněčného dělení při rakovině až po přenos neuro signálů při učení a paměti. Protože fosfoproteiny regulují prakticky všechny důležité buněčné funkce, rádi říkáme, že "fosfoproteiny jsou slovesa proteomického jazyka". Schopnost stanovit stav fosforylace konkrétních proteinů je velmi užitečná při hledání funkce daného proteinu a způsobu, jakým je tato aktivita ovlivňována buněčnými signály. Takové testy jsou také zásadní pro identifikaci léčiv, která mohou ovlivnit fosforylaci, a tím i funkci konkrétních proteinů.

Historie detekce fosfoproteinů začala radioaktivně.

Bohužel vizualizace fosfoproteinů v prvních studiích vyžadovala radioaktivní značení fosfátové skupiny pomocí 32P. To bylo náročné na práci: fosforylují se doslova tisíce proteinů (a inkorporují 32P), a proto je k detekci sledovaného proteinu od všech ostatních značených proteinů nutná imunoprecipitace. Avšak i když je imunoprecipitace provedena a sledovaný protein je izolován, není možné určit, které místo na proteinu bylo fosforylováno. To je velmi důležité, protože některá místa na proteinu jej mohou zapnout, zatímco jiná vypnout. Kromě toho je velmi obtížné kvantifikovat 32P studie, protože samotné metabolické změny mohou změnit úroveň značení 32P. A konečně, studie fosforylace in vivo jsou prakticky nemožné kvůli nemožnosti značit 32P in vivo.

Vývoj fosfospecifických protilátek začal před několika desetiletími s protilátkami proti fosfotyrosinu.

První zpráva o výrobě protilátek závislých na fosforylaci se objevila v roce 1981, kdy byly injekčním podáním benzylfosfonátu králíkům vyrobeny protilátky, které mohly detekovat proteiny obsahující fosfotyrosin (1). Tyto protilátky se staly klíčovými činidly ve výzkumu rakoviny, ale detekovaly fosfotyrosin na mnoha proteinech. Klíčovou nevýhodou těchto protilátek je nejen to, že detekují fosforylaci mnoha různých proteinů, ale také to, že podobně jako při studiích s 32P často detekují více fosforylačních míst na jednom proteinu. V podstatě takové protilátky ukazují, že dochází k fosforylaci, ale nedokážou určit, které proteiny a která místa na proteinu byla fosforylována. Bylo také učiněno několik pokusů o vytvoření protilátek, které by detekovaly fosfoserin nebo fosfotreonin, ale ty nebyly z příliš úspěšné.

Použití proteinů plné délky jako antigenů bylo cílenější, ale stále se ukázalo jako problematické.

Krátce po této první práci popsali Nairn a jeho kolegové výrobu protilátky specifické pro fosforylovanou formu G-substrátu, proteinu lokalizovaného v Purkyňových buňkách mozečku a fosforylovaného cGMP-dependentní proteinkinázou (2). Protilátka byla připravena imunizací králíků purifikovaným fosfoproteinem G-substrátu, který byl fosforylován in vitro. Přes tento počáteční úspěch nebyly další pokusy o výrobu fosfospecifických antisér imunizací fosfo-formou intaktních proteinů příliš úspěšné, pravděpodobně kvůli dvěma významným faktorům. Zaprvé se předpokládá, že mnoho fosforylovaných proteinů podléhá během imunizace rychlé defosforylaci, bez ohledu na způsob injekce, což vede ke ztrátě požadovaného fosfoepitopu. Za druhé, holoproteiny obecně obsahují více imunogenních epitopů. Vzhledem k tomu, že fosforylovaná skupina je pouze velmi krátká část tohoto dlouhého proteinu, je malá pravděpodobnost, že bude požadovaná fosforylovaná skupina rozpoznána protilátkami vyrobenými proti antigenům proteinů plné délky.

Přímější přístup k vytváření místně specifických fosfo-protilátek využívá fosforylované formy syntetických peptidů.

Krátké peptidy tvořené 15-20 aminokyselinami bezprostředně obklopujícími fosforylovanou aminokyselinu, která je předmětem zájmu, zaměřují imunitní odpověď pouze na specifické fosforylované místo. Tyto krátké peptidy jsou navíc obecně odolné vůči defosforylaci. To však není absolutní, protože některé peptidy se defosforylují. To vede ke vzniku protilátek i proti nefosforylovanému peptidu. Proto je nezbytné, aby sérum odebrané po těchto imunizacích peptidy bylo přečištěno, aby se oddělily protilátky proti fosfo-peptidům od protilátek, které rozpoznávají defosfo-peptidy.

Jak fosfo-, tak defosfo-peptidy jsou velmi užitečné při purifikaci fosfo-specifických protilátek.

Obecný protokol pro výrobu protilátek specifických pro fosforylační stav vyvinul jeden z našich spoluzakladatelů: Andy Czernik a jeho kolegové (3). Pomocí sekvenční chromatografie se nejprve pozitivně selektují fosfoprotilátky od defosfoprotilátek průchodem séra přes kolonu spojenou s fosforovaným peptidem použitým jako antigen. Po tomto kroku následuje negativní selekce přes kolonu s defosforylovanou formou peptidu. Podrobnosti o tomto purifikačním postupu naleznete na našich webových stránkách.

Dnešní fosfospecifické protilátky se vážou na cílové proteiny pouze tehdy, když je protein ve fosforylovaném stavu.

Díky vývoji této revoluční imunochemické techniky je nyní možné vyvinout fosfospecifické protilátky, které lze použít ke stanovení úrovně fosforylace konkrétního místa na určitém proteinu. Práce s nimi je mnohem jednodušší, protože protilátka značí POUZE protein, který je předmětem zájmu. Při IP není nutné oddělovat ostatní proteiny a není nutné používat značení 32P. Protilátky lze tedy použít jak ve WB, tak v IHC k zobrazení relativní intenzity fosforylace specifického místa na cílovém proteinu. Při použití této protilátky v IHC je navíc možné identifikovat konkrétní buňky, ve kterých byl protein aktivován. Použití fosfospecifických protilátek při IHC se budeme věnovat v našem blogu.

Pochopení funkce fosfoproteinů vedlo k velkému pokroku v léčbě rakoviny.

Fosfospecifické protilátky způsobily převrat ve studiu fosforylace proteinů a významně napomohly vývoji řady nových léků, které jsou zaměřeny na fosfoproteiny a slouží k léčbě chorobných stavů. Právě v léčbě rakoviny se léky ovlivňující fosforylaci používají a zkoumají nejvíce. Nejběžnějšími léky souvisejícími s fosforylací jsou inhibitory malých molekul kináz. Tyto inhibitory představují téměř čtvrtinu současného úsilí v oblasti objevování a vývoje léčiv. Inhibice odlišných kinázových signálních drah může být méně cytotoxická pro nenádorové buňky, čímž ovlivňuje selektivní zabíjení nádorových buněk s menší toxicitou (4).

Kromě Western blotu: nečekaná příležitost pro IHC a IF.

Fosfospecifické protilátky se velmi široce používají při Western blot analýzách fosfoproteinů. V úžasném světě imunohistochemie se však tyto protilátky používají podstatně méně. Nedostatek studií využívajících IHC/IF je nešťastný vzhledem k výrazným detailům o buněčné a subcelulární lokalizaci fosfoproteinů, které by tyto studie mohly poskytnout. Ve společnosti PhosphoSolutions jsme vynaložili velké úsilí na validaci mnoha našich fosfo-protilátek pro IHC/IF. Kromě toho jsme napsali kapitolu pojednávající o použití těchto protilátek v IHC/IF. V některém z dalších blogů se budeme zabývat osvědčenými postupy pro použití fosfo-protilátek v IHC/IF.

Převzato z webu Phosphosolutions:https://www.phosphosolutions.com/pages/history-of-phospho-antibodies